产品货号:
KL220130
中文名称:
T3体外转录加帽试剂盒
英文名称:
T3 in vitro Transcription and Capping Kit
产品规格:
5T
发货周期:
1~3天
产品价格:
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本试剂盒基于沙门氏噬菌体T3 RNA聚合酶,用于RNA体外转录及加帽。利用含有T3启动子的模版DNA,以NTP和m7G(5')ppp(5')G为底物,从T3启动子下游开始合成与模板DNA中一条链互补的RNA,简单快速获得大量的RNA分子(含带帽RNA)。
- 即开即用,用户只需提供含T3启动子的DNA模板即可以进行体外转录实验,不需单独准备每一个成份。
- 体外转录和加帽同管一步式进行,不需要先体外转录再加帽。
- 单溶液预配液,减少加样次数,避免了操作误差,增加了可重复性。
- 模板DNA可以是线性化的质粒DNA,也可以是PCR扩增产物。
- 可以合成的RNA的最佳长度在20nt到5000nt之问。
- 产品配方经过精心优化,每微克DNA模板可以合成2~6μg RNA。
- 得到的加帽RNA比不加帽的RNA更稳定,可以用于RNA结构研究、核解生物化学、体外翻译、RNA-蛋白质相互作用、反义技术、SELEX技术和RNA干扰(RNAi)等实验。
组分 | 规格 |
2×T3体外转录及加帽预配液 | 50μL |
T3 RNA聚合酶-RI混合液 | 5μL |
RNase-free水 | 1mL |
保存:-20℃,有效期1年。
一、制备DNA模板
PCR片段和质粒DNA都可以用作体外转录的模板,但是必须注意以下几点。
- 必须使用线性化的DNA。如果是质粒DNA,则必须先用适当的限制性内切酶切成线状。
- 是需要转录的DNA序列的上游必须有T3启动子。如果模板是PCR产物,则可以在设计引物时将T3启动子序列(5'AATTAACCCTCACTAAAGG 3')加上。如果是将DNA片段克隆到载体上,则需要选择有T3启动子的载体,并且克隆位点必须位于T3启动子下游。
- 需要转录的DNA序列的下游端最好不要是3'突出。如果是3'突出(如选择了Pst I来线性化质粒),则最好用T4 DNA聚合酶修平。
- 必须保证DNA模板中没有RNase。由于提取质粒DNA的过程中一般要使用大量的RNase A,因此质粒DNA一般都有严重的RNase A污染,所以在用作模板前,最好采取胶回收得方法回收质粒DNA。并且加入少量总RNA一起保温,然后电泳检测RNA是否被降解,以此判断纯化的DNA模板是否有残留RNase A。
二、体外转录及加帽反应
- 如果有N个样品,强烈建议做一个阴性对照,故共设置N+1个反应,这样一起并排电泳时容易判断哪个条带是模板DNA,哪个条带是扩增得到的RNA。在N+1个RNase-free的塑料离心管中,在室温下(不是在4℃下)按次序加入下列成分:
成分 N个样品管 阴性对照 DNA模板 各50ng(PCR片段模板)或各1μg(质粒模板) 2×T3体外转录及加帽预配液 10μL 10μL T3 RNA聚合酶-RI混合液 1μL 不加 RNase-free水 至20μL 至20μL - 此为20μL反应体系的用量,对其他体积的反应体系,各成分的用量可以按比例增减。如果需要标记RNA探针,则需要另购NTP与2×T3转录预配液分开提供的试剂盒。
- 37℃保温1~2小时。
- 延长保温时间并不能提高产量。
- 70℃加热10分钟灭活T3 RNA聚合酶。
- 取1~3μL电泳检测转录效果。比阴性对照多出的条带就是扩增得到的RNA(由于检测时的电泳不需要碱变性胶,并且合成的RNA长度不一定均匀,即使长度均匀,但由于自生形成发夹结构,因此不一定呈现清晰的电泳条带。但由于RNA是单链,分子量比同样长度的DNA小一倍,因此转录得到的RNA一般比其模板电泳速度更快。
- 定量,可以用自备的单链RNA定量试剂盒检测浓度,也可以肉眼比较电泳胶上RNA和DNA的强度。由于RNA是单链,跟核酸染料结合力低,因此同等亮度的RNA条带,其RNA分子数一般比DNA的分子数多一倍。1μg DNA模板一般可以合成2~6μg的RNA(含带帽RNA)。
- 得到的RNA可以放-80℃保存(溶液中有DNA模板和未使用的NTP)。
三、DNA模板清除(可选)
- 若需进一步去除转录反应体系中的DNA模板,可参考下列步骤,但所用试剂需另行购买,本试剂盒不提供。
- 在体外转录结束后,在反应体系中加入3~5U自备的RNase-free DNase。
- 37℃保温15~30分钟。
- 补水到100μL,
- 用自备的等体积(100μL)的Tris饱和酚-氯仿抽提一次去除残留的DNase和RNA聚合酶。
- 在上清中加200μL自备的微量核酸沉淀剂(用前需要摇晃混匀),振荡后15000rpm离心3~5分钟,弃上清。
- 加入1mL 75%乙醇,震荡10秒后15000rpm离心3~5分钟,弃上清。
- 短暂离心数秒,用枪头吸弃上清。
- 晾干半分钟,所得沉淀即去除DNA模板后的RNA。可溶于RNase-free水中后立即使用或放-80℃长期保存。
- 没有RNA产物:
最常见原因是DNA模板有RNase污染,测试方法是将纯化的有两条典型RNA条带的总RNA跟模板DNA一起保温,再检测RNA是否降解。本试剂盒缓冲液和酶混合液中有RNase inhibitor,如果模板RNase污染严重,可能需要用户补加RNase inhibitor。 - RNA产量低:
最常见的原因是DNA模板序列。在转录序列的第一个和第二个碱基最好都是G,在前14个碱基内避免有U存在。 - RNA长度比预期的短:
可能是模板序列中有T3 RNA聚合酶的终止序列。可以改用SP6或T7体外转录试剂盒(启动子也必须做相应的改变)。 - RNA长度比预计的长:
T3 RNA聚合酶跟Taq DNA聚合酶一样,有不依赖于模板的加尾功能,最多有一半的RNA可以带一个或两个碱基的尾巴。如果RNA长度比预计的长很多,模板又是质粒,则可能是质粒线性化不彻底。 - 得到的RNA是5'单磷酸还是三磷酸:
如果使用GTP,则得到的RNA是三磷酸,体外转录时如果保温时间太长(如12小时),则有50%的三磷酸会变成单磷酸。如果在转录体系中加入GMP,则T3 RNA聚合酶将优先使用GMP,所得RNA产物中5'端是单磷酸的比例将大大增加。
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